植物叶绿体提取试剂盒
● 产品简介:
叶绿体(Chloroplast)是质体的一种, 是高等植物和一些藻类所特有的能量转换器,是光合作用的反应场所。在高等植物中叶绿体象双凸或平凸透镜,长径5~10μm,短径2~4μm,厚2~3μm。高等植物的叶肉细胞一般含50~200个叶绿体,可占细胞质的40%,叶绿体的数目因物种细胞类型,生态环境,生理状态而有所不同。叶绿体由叶绿体外被(chloroplast envelope)、类囊体(thylakoid)和基质(stroma)三部分组成,含有3种不同的膜:外膜、内膜、类囊体膜和3种彼此分开的腔:膜间隙、基质和类囊体腔。本公司的植物叶绿体提取试剂盒采用密度梯度离心方法,可以从多种植物中提取高纯度的叶绿体。
1. 即用型试剂盒,用户不需要单独配制各种溶液。
2. 试剂盒可以用于叶绿体粗提,所得叶绿体含少量其他细胞器污染,可用于后续的SDS-PAGE,Western,ELSIA和蛋白组分析。也可以用于叶绿体精提,所得叶绿体完整,可用于后续的光合作用,电子链和磷酸化,跨膜转运,体外叶绿体蛋白合成,蛋白定位等研究。还可用于的叶绿体膜,基质,类囊体,叶绿体DNA和叶绿体RNA纯化。
3. 以每次处理30 g叶片计算,本产品可使用8-10次提取,每次能得到3-5 mg左右叶绿体。
4. 已经成功用于菠菜,大豆,莴笋,白菜,烟草和甜菜等植物,还可用于更多植物(可能需要优化条件)。
● 贮存及运输:
4-8℃保存,至少一年有效;试剂盒常温运输。
● 产品组成:
产品货号 | 产品名称 | 包装 | 贮存 |
RTU5001-01 | 叶绿体提取缓冲液(5×) | 300 ml | 4-8℃ |
RTU5001-02 | 密度梯度分离试剂 | 40 ml | 4-8℃ |
RTU5001-03 | BSA(100mg/ml) | 15 ml | -20℃ |
DT0150P | 1 M DTT(粉末装) | 1.5 ml | -20℃ |
RT-1070 | 70 μm过滤筛 | 5个/包 | RT |
说明书 | - | - |
● 使用说明:
注意:叶绿体对温度高度敏感,所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行,所用器皿和溶液均需要在4℃预冷。离心时一定要在4℃进行,离心力以g而不是rpm计算。如果需要研究叶绿体的功能,提取过程还需要在昏暗的光线条件下进行。
1.1 材料预处理:
实验前1-2天将植物放在暗室培养以减少叶绿体中淀粉颗粒的形成,否则离心时这些颗粒很容易使叶绿体破裂。叶片在实验前需先用自来水洗净,再用蒸馏水淋洗,去掉多余水分。如果叶片采集后不能立即处理,则保存时需要保持叶片湿润,即使如此,叶片的放置时间也不能超过一天。
1.2 1×叶绿体提取缓冲液(即用型)配制:
1×叶绿体提取缓冲液(即用型) 配制量150 ml | |
叶绿体提取缓冲液(5×) | 30 ml |
BSA(100mg/ml) | 1.5 ml |
1 M DTT | 150 μl |
灭菌水 | 定容至150 ml |
冰上预冷待用,现用现配,不建议贮存 |
注:一个30克样品提取反应需要 135 ml 1×叶绿体提取缓冲液(即用型)。
1.3 叶片匀浆:
1.3.1 新鲜采集植物叶片(约30克),快速去除叶脉并将叶片剪成1-3 cm2大小的碎片并浸泡在适量的预冷的1×叶绿体提取缓冲液(即用型)中(每克叶片加4 ml)。
1.3.2 将浸泡了叶片的溶液转移到Waring匀浆机(即家用制备果汁的匀浆机)中,低速匀浆10秒,避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入匀浆机底部后,再低速匀浆10秒。注意:除Waring匀浆机外,还可以选择Dounce玻璃匀浆器,Polytron匀浆机和研磨(加玻璃珠)等裂解细胞的方法,但这些方法的单次处理量都比较小,需要将样品分成很多小份单独匀浆,然后再汇集。
1.3.3 用过滤筛过滤匀浆液,可先将滤液收集到预冷的200 ml量筒中,再等分到4个预冷的50 ml的塑料离心管中(每个管中的滤液不要超过35 ml)。过滤筛可以反复使用。
1.4 离心去杂质:
在水平转子离心机上4℃ 200 g离心15分钟,沉淀为未破裂植物组织、的细胞或细胞核。
1.5 收集叶绿体粗提液:
1.5.1将上清液(含叶绿体)转移到一个新的预冷的50 ml塑料离心管中。
1.5.2. 在水平转子离心机上4℃ 1100 g离心15分钟,小心弃上清,沉淀含叶绿体,呈浅绿色。
1.5.3 在沉淀中加入1.5 ml 预冷的1×叶绿体提取缓冲液(即用型),手弹离心管底部使叶绿体重悬,收集4管溶液(约6 ml),此溶液即为叶绿体粗提产物(含有破碎的叶绿体和完整的叶绿体),可直接用于后续的SDS-PAGE,Western,蛋白组分析。注意:重悬时最好避免溶液起泡,也不要用枪头吹打,否则叶绿体容易破裂。沉淀下有白色淀粉属于正常现象,但重悬叶绿体时避免将白色淀粉重悬。
1.6 完整叶绿体的纯化:
1.6.1 密度梯度重液配制:
在15 ml塑料离心管中先加入0.5 ml 1×叶绿体提取缓冲液(即用型)和2 ml密度梯度分离试剂,充分混合均匀,得80%密度梯度重液。
1.6.2密度梯度轻液配制:
在另一试管中将3 ml 1×叶绿体提取缓冲液(即用型)和2 ml 密度梯度分离试剂,充分混合均匀,得40%密度梯度轻液。
1.6.3 将密度梯度轻液小心铺在密度梯度重液之上,然后将第步骤1.5.3得到的叶绿体重悬液小心铺在密度梯度轻液之上。
1.6.4 在水平转子离心机上4℃ 3200 g离心15分钟(注:为了避免离心时损伤叶绿体,可调低离心机的升速和降速),最上层绿色带含破碎的叶绿体、线粒体和核糖体等,重液和轻液间的绿色带为完整叶绿体(如下图)。
1.7.1 1×叶绿体提取缓冲液(不加BSA,不加DTT)配制:
1×叶绿体提取缓冲液(不加BSA,不加DTT) 配制量20 ml | |
叶绿体提取缓冲液(5×) | 4 ml |
灭菌水 | 16 ml |
冰上预冷待用,现用现配,不建议贮存 |
1.7.2 重悬叶绿体:
用广口吸管小心将重液和轻液之间的绿色带(叶绿体)转移到新的离心管中,加入三倍体积预冷的1×叶绿体提取缓冲液(不加BSA,不加DTT),轻柔混匀。
1.7.2 离心收集叶绿体:
在水平转子离心机上4℃ 1750 g离心3-6分钟,小心将上清倒出后,在绿色的叶绿体沉淀中加入预冷的0.5 ml 1×叶绿体提取缓冲液(不加BSA,不加DTT),手指轻弹管底使叶绿体重悬。
1.7.3 将叶绿体重悬液转移到1.5 ml离心管中并避光保存,也可在相差显微镜下检查叶绿体完整性。叶绿体必须尽快使用,否则非常容易失去活性。所得精提叶绿体可用于后续的光合作用,电子链和磷酸化,跨膜转运,体外叶绿体蛋白合成,蛋白定位等研究。还可用于的叶绿体膜,基质,类囊体,叶绿体DNA和叶绿体RNA纯化实验等。
1.8 叶绿素A含量测定(可选):
通常叶绿体含量用单位叶绿素a含量来表示,即x mg 叶绿素a/ml 叶绿体悬浮液。
1.8.1 取20 μl 叶绿体悬浮液加入到980 μl 80%丙酮溶液中,混匀。
1.8.2 3000 g 离心5分钟,保留上清,测定OD652 吸光值,用80%丙酮做空白对照。
1.8.3 根据以下公式计算叶绿素a:
叶绿素a浓度(mg/ml)=(OD652×50)/36
50:稀释倍数
36:extinction coefficient in ml/cm·mg
1.9 实验示例: