Cell Counting Kit-8(CCK-8)

 产品简介：

CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。 WST-8是一种类似于 MTT的化合物，在电子耦合试剂1-Methoxy PMS存在的情况下，可以被还原生成橙黄色水溶性的甲臜（Formazan）。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

WST-8与传统的MTT，XTT，MTS，WST-1相比有明显的优点。首先，反应生成的formazan是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8更加稳定，检测线性范围更宽，灵敏度更高。

本试剂盒可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。

本试剂盒检测便捷，使用方便。仅含一管已经配制好的含有WST-8的CCK-8溶液，无须再进行任何配制等操作。无须使用同位素，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外的步骤去溶解甲臜。特别适用于大批量样品的检测。

另外，酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。

WST-8对细胞无明显毒性。加入CCK-8溶液显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间。

本试剂盒可以测定100个或500个样品。

●     保存条件：

CCK-8 溶液在避光，0-5℃的条件下可以保存一年，如长期保存，可在-20℃下保存 2 年，如需经常使用请将试剂存放在 0-5℃，为防止背景值增加干扰实验结果，请勿反复冻融。

● 操作步骤：

1.  在 96孔板中接种细胞悬液(100 μl /孔)，通常细胞增殖实验每孔约2000 个细胞，细胞毒

性实验每孔约5000 个细胞，具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素决定)。

2.  按照实验需要，进行培养并给予0-10 μl特定的药物刺激，处理一段适当的时间(例如: 6,12,

24或48小时)。

3.  每孔加入10 μl CCK-8 溶液。如果起始的培养体积为200 μl，则需加入20 μl CCK-8溶液，以此类推。可以用加相应量细胞培养基和 CCK-8但不加细胞的孔作为空白对照，若担心所使用的药物会干扰检测，需设置加相应量细胞培养液、药物和 CCK-8 溶液但不加细胞的孔作为空白对照。

4.  在细胞培养箱内继续孵育1-4小时，具体时间可以通过预实验确定。预实验时可以在0.5、

2和4 小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

5.  用酶标仪测定在450 nm处的吸光值，若无450nm滤光片，可以使用420-480nm 的滤光

片。如果样品为高浑浊度的细胞悬液，可以使用大于 600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定。

6.  如果需要暂时不测定 OD值，可以向每孔中加入10 μl0.1MHCl 溶液或者1%(w/v)的 SDS溶液，避光保存在室温，24 小时内吸光度不会发生变化。  

● 注意事项：

1.  使用96 孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，请注意蒸发问题。可将96 孔板外围一圈加培养基、水或 PBS保湿。同时，可以把96孔板置于培养箱内靠近水盘的位置以缓解蒸发。

2.  培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而不同。在正式实验前，建议先做预实验摸索铺板的细胞数量以及加入CCK-8 试剂后的培养时间。

3.  铺板时请注意保证每个孔细胞数量均匀，建议铺板过程中注意时常混匀，防止因细胞沉淀造成不均匀。加入CCK-8 后请前后左右轻轻晃动培养板数次，使培养基和CCK-8 溶液充分混匀。

4.  本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待测物质有氧化性或还原性，可在加CCK-8  之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。若药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

5.  加入CCK-8 时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色或 pH值已变化，建议换用新鲜的培养基。

6.  用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。

7.  本试剂盒系无菌灌装生产。在使用过程中，请在生物安全柜内无菌操作，避免污染。