植物原生质体制备试剂盒

● 产品简介：

植物原生质体是指脱去全部细胞壁由质膜包被的具有生命活力的裸露细胞。它具有细胞生命特征和全能型，是细胞无性系变异和突变体筛选的重要来源，同时也是植物遗传工程的理想受体和遗传改良的理想材料。酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶、离析酶和果胶酶能降解细胞壁成分，去除细胞壁，即可得到原生质体。试剂盒配套的酶混合物是纤维素酶R-10和离析酶R-10的混合物，优化的酶配比能很好地消化植物细胞壁，提取到良好的植物原生质体。

按照每次使用5 ml酶消化体系计算，本试剂盒可用于20次酶消化反应。本试剂盒每个5 ml反应体系可处理0.1 g左右的拟南芥叶片(约10~15叶片)，操作较好的情况下每5 ml体系可获得约50-70万个原生质体(不同植物不同操作会有一定的差异)，可满足约25-70个样品的原生质体质粒转染操作(按照每样1-2万个细胞计算)。

本试剂盒不含有原生质体转化试剂，需要转化请参见植物原生质体转化试剂盒（RTU4092 ）。

● 贮存、效期及运输：

  按照标签温度保存，至少一年有效。-20℃贮存组分4℃存放3-4不会影响使用效果。3-4天经常使用的情况，可以全部保存在4℃。

试剂盒常温运输。

● 使用说明：

   需要准备的材料（试剂盒不提供）：

   平头镊子；一次性刀片；50 ml离心管；1.5 ml离心管；水浴锅

一、原生质体分离：

即用型酶溶液配制

注：溶液I容易被微生物污染，使用时须严格按照无菌操作规范进行或者适当分装后使用。

55℃处理能灭活核酸酶和蛋白酶并促进酶的溶解；

即用型酶溶液现用现配，不建议配制后冻存后再使用；

溶解好的正常酶溶液应为澄清棕黄色溶液，如使用纯度不好的酶，溶液为不溶解的乳白色悬浊液，不能使用。

1. 酶解：

取生长状态良好的叶片切成0.5-1 mm的小条，按照0.1 克叶片（拟南芥约15-20个叶片）加5 ml即用型酶溶液的比例迅速将切割好的叶片小条浸泡于酶溶液中，避光，无需震荡，常温（20-25℃）酶解3小时，间歇混匀。

注：酶解时间与叶片种类，叶片生长状态有关，请根据实验需要适当调整酶解时间。3小时为拟南芥叶片推荐的酶解时间。如条件允许，可以使用微型真空泵常温避光条件下抽真空30 min，以使酶溶液更好地进入细胞间隙。酶溶液变为绿色表明有原生质体已经有分离，溶液为浓绿色表明原生质体已经大量分离。拟南芥原生质体大小约为30-50 μm，显微镜镜检后确定是否分离。叶片原生质体细胞显微镜下为绿色圆球状，叶绿体分散在整个细胞内，说明状态较好；如呈现不规则形状，说明原生质

体破碎或即将破碎。

 2. 漂洗：

        取适量溶液II-漂洗溶液（5×），用超纯水稀释为1×漂洗溶液。

酶解后加入等体积的1×漂洗溶液，如使用5 ml酶解体系，加入5 ml 1×漂洗溶液，轻柔混匀。

3. 过滤：

用孔径70 μm筛网过滤步骤2中的溶液，去除未消化的叶片，用5-10 ml 1×漂洗溶液冲洗酶解器皿和未消化的叶片1-2次，将所有的液体收到50 ml离心管中。

4. 第一次收集：

滤出液100g常温离心 2分钟，尽量去除上清。

注：为了避免原生质体离心时贴在管壁，建议整个实验过程使用水平转头；离心时，可调低离心机的升速和降速。升速过快，原生质体可能离到管壁上；降速过快，可能导致管底原生质体悬起。建议升速和降速分别都使用3。

5. 第二次收集：

加入2-5 ml 1×漂洗溶液，用剪尖的蓝吸头重悬原生质体，冰浴30分钟，原生质体在重力

作用下可以沉降到离心管底部，尽量吸除上清，收集原生质体。(如果发现原生质体沉降的速度比较慢或者得率比较低，也可以考虑常温100 g离心1-2 min收集原生质体)。

6. 重悬：

小心去除上清溶液，不要触动原生质体沉淀，沉淀用剪尖的蓝吸头重悬于1 ml溶液III中即为原生质体溶液。（可以用血球计数板计数，根据原生质体数量调整溶液III的加入体积，使得原生质体密度为2×10⁵/ml或更高）。

注：制备好的原生质体可以在4oC或冰浴保存至少24 h。

二、实验示例：

                使用植物原生质体制备试剂盒转染拟南芥原生质体的效果图。

实验步骤：称取0.48 g转化试剂于2 ml 离心管中，加入转化试剂溶解液后，颠倒混匀，蒸馏水定容至2 ml，使转化试剂充分溶解后备用。在2 ml的圆底离心管中加入10 μl（20 μg）EGFP质粒 (植物用绿色荧光蛋白)，加入100 μl制备好的原生质体，轻柔混匀后加入110 μl当日配制好的转化试剂溶液，轻柔混匀，常温静置5 min后加入440 μl 1×漂洗溶液终止转化，轻轻颠倒混匀，常温100 g离心1 min，去除上清，再加入0.5 ml 1×漂洗溶液，轻柔重悬原生质体，常温100 g离心1 min后，尽量去除上清，收集原生质体。加入1 ml溶液V，小心重悬原生质体后水平放置25℃培养过夜(约16h)，次日于荧光显微镜下检测EGFP荧光信号。