植物硝酸还原酶(NR)活性检测试剂盒

 产品简介：

硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR，EC1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，它的活性高低直接影响到植物对土壤中硝态氮素的利用，影响作物的产量和品质。硝酸还原酶是一种诱导酶，通常在有 NO₃^-存在时，会诱导硝酸还原酶的活性。

测定原理：NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO₃ˉ+NADH→ NO₂ˉ +NAD＋+H₂O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸α-萘胺定量生成红色偶氮化合物； 生成的红色偶氮化合物在 540 nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。

按照每次提取使用1 ml提取缓冲液计算，该产品可以使用45-50次。

● 贮存和效期：

  试剂盒常温运输；按照标签温度贮存；开封使用后有效期一年。

● 自备材料：

植物根茎、叶子等；剪刀；离心管；分光光度计；水浴锅；离心机；1ml比色皿

● 操作步骤：

用前必读：由于不同材料NR活性差距较大，首次实验时建议取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

准备30度水浴；分光光度计调节到540nm，开机预热30分钟。

一、 样本处理：

1. 样品的诱导前处理：

将NR诱导剂（50×）用蒸馏水稀释50倍，如取49 ml蒸馏水加入1 ml 诱导剂。 将植物样品浸泡于诱导剂中，浸泡2小时。

注：如未经诱导，植物体内NR活性很低，预测定结果没有活性(OD_测定管＜OD_对照管)则需要诱导处理。

二、 硝酸还原酶提取：

2. 即用型NR提取缓冲液配制：

注：配制好的即用型NR提取缓冲液可以4℃短期保存一周；

3. NR提取步骤

取诱导后的样品或新鲜植物组织，清洗干净，擦干，液氮中研磨，1 cm²叶片（1分硬币大小）或0.1g叶片粉末加入1 ml 即用型NR提取缓冲液，颠倒混匀， 12000rpm4℃离心 5分钟，上清即为NR提取液，冰浴放置备用。

注：NR提取液最好立即测定，不建议保存。

三、硝酸根还原步骤:

4. 即用型标准液配制：

取试剂7-标准液（100×）稀释100倍，即取10 μl加990μl灭菌水中，混匀，即用型标准液浓度为0.1 μmol/ml（100 μM）。

5. 即用型NADH配制：

   根据标签所示加入超纯水配制试剂4-NADH（10×），稀释10倍，如取100 μl加900 μl灭菌水，混匀，冰浴备用。

6. 参考下表设置检测反应体系，按照顺序在1.5ml离心管中依次加入试剂（单位μl）：

四、计算：

7. 用蒸馏水调零分光光度计，取1ml加到比色皿中，分别测定各管在540nm的吸光值，记录读数。

NR单位定义（Units）：每小时每克鲜重样品中催化产生1μmol NO₂^-的量为一个NR活力单位。

NR活性（μmol/h/g FW）=（测定OD-对照OD）/（标准OD-空白OD）×标准品浓度（0.1 μmol/ml）×（取样体积0.1 ml）/（样品鲜重g×反应时间0.5 h）×样品测定前稀释倍数（如0.1g叶片用1ml提取缓冲液，即稀释10倍）

此公式整理为：NR活性（μmol/h/g FW）=0.2/FW×（测定OD-对照OD）/（标准OD-空白OD）

8. 计算举例：

0.1克植物鲜重材料使用1 ml提取缓冲液提取：稀释倍数为10

测定OD=0.159 对照OD=0.121 标准OD=0.16 空白OD=0.004

NR 活性（μmol/h/g FW）=0.2/0.1×（0.159-0.121）/（0.16-0.004）=0.012