细胞转染是指将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展,转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中,其应用越来越广泛。 技术内容:将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞 1、瞬时转染:外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其他调控原件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。 1、DEAE-葡聚糖法 下面以脂质体介导法给大家作为讲解 一、材料 MyoD表达质粒和EGFP表达质粒 DMEM培养基 链霉素/青霉素(双抗) FCS(小牛血清) PBS(磷酸盐缓冲溶液) 胰酶/EDTA消化液 转染试剂(TransFast 二、器材 三、 实验步骤 1、细胞传代 (1) 试验准备:200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌),酒精棉球,废液缸,试管架,微量移液器,记号笔,培养皿,离心管。 (2) 弃掉培养皿中的培养基,用1ml的PBS溶液洗涤两次。 (3) 用Tip头加入1ml Trypsin液,消化1分钟(37℃,5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁,观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 (4) 加入1ml的含血清培养基终止反应。 (5) 用Tip头多次吹吸,使细胞完全分散开。 (6) 将培养液装入离心管中,1000rpm离心5min。 (7) 用培养液重悬细胞,细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。 (8) 将合适体积完全培养液加入离心管中,混匀细胞后轻轻加入培养皿中,使其均匀分布。 (9) 将培养皿转入CO2培养箱中培养,第二天转染。 2、细胞转染 (1)转染试剂的准备 A. 将400ul去核酸酶水加入管中,震荡10秒钟,溶解脂状物。 B.震荡后将试剂放在-20℃保存,使用前还需震荡,。 (2) 选择合适的混合比例(1:1-1:2/脂质体体积:DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA,震荡后在加入合适体积的转染试剂,再次震荡。 (3) 将混合液在室温放置10-15分钟。 (4) 吸去培养板中的培养基,用PBS或者无血清培养基清洗一次。 (5) 加入混合液,将细胞放回培养箱中培养一个小时。 (6) 到时后,根据细胞种类决定是否移除混合液,之后加入完全培养基继续培养24-48小时。 3、第二次细胞传代 (1) 在转染后24小时,观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 (2) 再次进行细胞传代,按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。 (3) 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
研究内容:研究和控制真核细胞基因功能
应用:基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验
目的:快速分析
筛选方法:抗生素抗性
表达持续时间:随细胞分裂而稀释至丢失48-72小时
目的DNA与宿主染色体:未整合
2、稳定转染:外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整个率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1、104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶,潮酶素B磷酸转移酶,胸苷激酶等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。
目的:为获得稳定表达外源基因的单细胞克隆
筛选方法:抗生素抗性
表达持续时间:随宿主细胞本身基因组一样复制,转录,翻译,并被稳定遗传
目的DNA与宿主染色体:未整合
是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。DEAE-葡聚糖是阳离子多聚体,它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取。DEAE一葡聚糖转染已成功地应用于瞬时开始,但用于稳定转染却不可靠。
2、磷酸钙共沉淀转染法
由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定染的研究。方法是,先将DNA和氯化钙混合,然后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀,后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上,通过胞膜的内吞作用摄人DNA。
3、脂质体介导法(目前应用最广泛)
原理:阳离子脂质体试剂与DNA混合后,形成一种稳定的脂质双层复合物,DNA被包在脂质体中间,这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞中,脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融合,DNA被释放到胞浆中。
【主要应用】:瞬时转染 稳定转染.
【特点】:使用方法简单,可携带大片段DNA,通用于各种类型的裸露DNA或RNA,能转染各种类型的细胞,没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率,但在体内,能被血清清除,并在肺组织内累积,诱发强烈的抗炎反应,导致高水平的毒性,很大程度上应用受限制。
4、物理方法(电穿孔、显微注射及基因枪)
293T细胞
20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头
酒精灯
废液缸
血球计数板
涡旋振荡器
恒温水浴箱
台式离心机
35mm培养皿
转染管
15ml离心管
观察用倒置显微镜
荧光显微镜和CCD