转染(transfection)是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。

常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。

转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。

一、物理-化学方法

　　脂质体转染法：采用脂质体转染试剂，将遗传物质如质粒, siRNA等转移至细胞内。

　　此种方法易于操作且不需要许多步骤或特殊的专业知识。通常情况下，你只需要一种转染试剂和一种兼容的生长培养基 (通常是低血清且具有良好的缓冲作用，使细胞在转染过程中保持活性)。不同的厂商有自己的配方试剂，有些可以为特定的细胞系设计配方，所以检查你的细胞系是否有最佳脂溶性配方。此外，这种方法可与一系列细胞兼容，如HEK 293.

　　脂质体转染试剂价格昂贵，但转染效率高，从长远来看是值得的。

　　DEAE-葡聚糖法：它是一种阳离子聚合物，可以与带负电荷的DNA和蛋白质结合，进而被细胞吞噬。

　　聚合物浓度、核酸或蛋白质与聚合物的比值，以及转染的持续时间是重要的优化参数，另外，此方法对附着细胞的转染非常有效，也可用于某些悬浮细胞系。

　　缺点是一些细胞类型对葡聚糖特别敏感，可能会发生形态变化或者抑制细胞生长。

　　磷酸钙共沉淀法：DNA与浓缩的氯化钙溶液混合，然后添加到含有磷酸盐离子的缓冲液中，形成磷酸钙-DNA沉淀物，从而被细胞吸收。

　　这种方法价格便宜且被广泛使用，但这种方法转染效率不稳定，可能会发生DNA聚集等，影响转染的效率，对试剂浓度、PH值等的要求也比较高。

　　电穿孔法：将细胞短暂暴露于电场中，短脉冲使细胞膜暂时穿孔，可以吸收外来的遗传物质，此方法也适用于传递蛋白质。

　　目前有许多电穿孔装置，操作不需要专门的专业知识，但在购买之前一定要向供应商索要设备的演示，确保它对你的细胞系有效。最佳的电压、持续时间和脉冲数可以增加外来材料的渗透性，对每个不同的细胞系你需要仔细优化这些参数。但是并不是所有细胞都能忍受电穿孔，有些细胞会死亡，另外，电穿孔仪也是相对昂贵的。

　　二、生物方法

　　腺病毒转导：对于转染困难的细胞，利用病毒载体将遗传物质转移到哺乳动物细胞中此方法存在病毒传播的风险，需要适当的安全预防措施。另外，需要包装细胞系产生能携带目的DNA的病毒颗粒。

　　成功转染的诀窍：

　　 哺乳动物细胞系的转染并不简单，使用哪种方法取决于很多因素，例如: 你的实验室的预算、电穿孔设备、你的细胞类型等等，选择最适的转染方法会有较好的转染效率。

1.抗生素耐药性示例----筛选转染成功的细胞

　　引入遗传物质(通常是一个质粒)的同时细胞会产生一种耐抗生素的基因。在转染的最初阶段，细胞可能会有点“萎靡”，需要时间来恢复，一两天之后，你就可以把它们暴露在抗生素环境下。没有接受质粒的细胞将无法承受，并且会死亡，你就可以用转染的细胞继续你的实验。

2.尽早确定你的转染效率

　　比较不同转染方法的一个快速而简单的方法是使用一个携带荧光标记蛋白的质粒，这样你就可以在显微镜下观察转染的细胞。你可能需要尝试几种不同浓度的DNA / siRNA来确定你的细胞系的最佳转染效率。

3.尝试使用永生细胞系

　　与原始细胞系相比，永生细胞系无疑更容易工作，但仍然可能会观察到细胞毒性作用，影响整个转染效率。

三、细胞转染的常见问题及注意事项

一、转染效率低

影响转染效率因素很多，主要因素有细胞培养物、血清、载体构建、DNA质量以及转染技术等。

1.没有使用优化条件：优化阳离子脂质体试剂和DNA的量。

2.DNA-阳离子脂质体试剂复合物在存在血清条件下形成。

3.存在抑制剂：不要在用于制备DNA-阳离子脂质体复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素。透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。

4.不恰当的细胞密度：转染时融合度应为70%-90%。

5.阳离子脂质体试剂冻结：不要使用冻结的或储存温度低于4℃的阳离子脂质体试剂。

6.质粒纯化的问题。

二、细胞死亡率高

1.DNA量太高

2.阳离子脂质体试剂量太高

3.在转染过程中使用抗菌素：在转染过程中不要使用氯霉素，青霉素或链霉素，因为阳离子脂质体试剂使细胞更敏感。

4.细胞太少

5.在无血清条件下细胞活性降低：使用OPTI-MEM培养基。确保在不存在血清的条件下形成复合物。

6.阳离子脂质体试剂被氧化：不要过分搅动或振荡阳离子脂质体试剂，这可能会形成阳离子脂质体试剂的过氧化物。

7.对于稳定转染，筛选抗生素加入的太快：在加入筛选性抗生素前至少预留24-48h使细胞表达抗性基因。   

细胞转染注意事项

1.如为贴壁生长细胞，一般要求在转染前一日，必须应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，转染当日的细胞密度以70-90%（贴壁细胞）或2×106-4×106细胞/ml（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4h换一次新鲜培养液。

2.用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。

3.有血清时的转染：

1）在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。其实，只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。

2）阳离子脂质体和DNA的最佳量在使用血清时会有所不同，因此在转染培养基中加入血清时需要对条件进行优化。

3）大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康。对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用OPTI-MEM培养基，一种营养丰富的无血清培养基。

4.培养基中的抗生素

抗生素是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率降低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素。

对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素（稳定转染最常用的抗性筛选试剂）的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。

5.设置阳性对照和阴性对照。

6.一般在转染24-48h，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，24-48h后即可进行靶基因表达的检测实验。

7.如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素和新霉素等。