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如何判断反转录第一链cDNA合成成功

cDNA 在反转录界一直大名鼎鼎,但 TA 鲜少抛头露面!那我们怎样才能辨别出 TA 的身份呢?按理来说,RNA 的质量没问题(28 s 和 18 s rRNA 清晰、明显,亮度比符合 2:1),那么反转录产生的 cDNA 一般是不会出现问题的。


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(来源于网络)


和小编一起来听听学霸们怎么说?


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一般都可以用电泳检测是否合成适当大小片段的带,如果你是想看它的大小肯定可以,如果想看他碱基有没有出错当然还是测序或者使用探针检测,就是比较麻烦。

用PCR检测合成的cDNA中管家基因的量,如果出现比较好条带,基本可以证实你的cDNA没有问题,我们实验室一致这样控制。

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如果不怕烦的话,可以在转第一链时加入少量同位素标记的dNTP,然后看一下放射比活度或做个放射自显影。也可在合成双链后跑电泳看一下。

做内参照啊!如GAPDH,β-actin,β-MG等。

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这么多学霸出谋划策,你,懂了吗?


那小编给大家做了总结,汇报如下,请各位霸霸查收~


选择试剂盒:您做反转录实验想得到什么样的产物?


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如何检测第一链cDNA合成成功?



01

cDNA电泳检测

取约5ul反应产物,在1%琼脂糖凝胶上电泳,EB染色,紫外成像检测,呈现出大小在200-10Kb的拖带,其中重心区域小1-4Kb之间,这说明反转录完全,得到了高质量的cDNA

02

cDNA测序

全长双链cDNA做分子克隆实验,然后通过测序结果精确判断。

  1. Oligo(dT)18和Random Primers按比列使用可解决poly(A) mRNA模板限制和长度限制的问题

  2. 序列特异性引物可获得你想要得目的序列

03

探针检测

qPCR或RT-qPCR步骤

04

管家基因/内参基因

以反转录产物为模板,扩增内参基因,扩增有结果,说明cDNA的质量基本可以保证,这个方法限制于随机引物扩增(因为管家基因片段多数较短)。

而Oligo(dT)18与序列特异性引物扩增或我们做LD PCR(2kb、10kb等长片段)时,这些内参扩增的几率远大于全长或大片段cDNA的扩增,这时可能就无法通过内参来检验cDNA扩增结果的好坏。

05

同位素标记

反转录中加入少部分同位素标记的dNTP

放射比活度或放射自显影检测



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