WB是检测蛋白质及蛋白质翻译后修饰的经典方法，可在简单或复杂的生物样品中提供有关靶蛋白的半定量或定量数据，WB步骤复杂，

通常包括：蛋白样本制备→电泳→转膜→封闭→孵育一抗→孵育二抗→显影→分析，

WB任何过程中出现的漏洞均可影响结果的灵敏度和重复性，必须注意将WB的每个步骤标准化，今天给大家分享WB各个过程中需要注意的细节！！！

按组织净重(g)：裂解液体积(ml)=1：10的比例加入相应体积的裂解液(加入终浓度为1mM的PMSF、适当浓度的蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂，以避免内源性酶分解蛋白，影响蛋白质的抽提)进行匀浆。

蛋白质的样品制备是westemblotting的第一步，也是关键步骤，要想获得所有蛋白质，应注意以下问题：

(1)在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性；

(2)选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价二硫键，使其形成各自多肽的溶液；

(3)尽量去除核酸，多糖，脂类等分子的干扰，在裂解完毕离心之后小心取中层澄清溶液，注意不要吸到底层沉淀和上层脂类；

(4)防止蛋白在处理过程中的人为修饰，制备过程必须在低温下进行，以避免细胞破碎释放出各种酶类的修饰。(注意：可以适当加入PMSF等酶抑制剂)

(5)样本制备完后分装保存，但是注意不要反复冻融。

30%的PAG配置完后过滤于4C保存，10% SDS室温保存。AP不稳定，用时现配。（注意：分子量较小的蛋白选用较大浓度的凝胶）

制胶关键是聚合时间，分离胶聚合控制在从加入10% AP和TEMED至开始凝胶，时间为10-20min(未完全凝聚)，浓缩胶最佳聚合时间为8-10min，可通过控制AP和TEMED量来控制。AP和TEMED的量过高，局部胶疑的太快，会使疑胶不均匀，电泳蛋白条带会弯曲。环境温度较高时，应减少AP和TEMED的量。空气中氧气也会影响胶的聚合，所以在分离胶上面应加一层水或正丁醇以隔绝氧气。

(1)条带出现微笑现象(中间凹两边翘起)：主要是凝胶中间部分凝固不均所致，应待凝胶充分凝固后电泳，或者催化剂加入后充分混匀；

(2)条带出现“皱眉”现象(中间鼓坡两边向下)：两玻璃板之间底部气泡所致，应排除底部气泡；

(3)带出现拖尾现象：主要是样本溶解效果不佳，分离胶浓度过大，电泳缓冲液放置时间过长。建议：加样前离心，选择适当的样本缓冲液，加适量的样品促溶剂；使用新配置的电泳缓中液，降低凝胶浓度或使用梯度凝胶。

(4)蛋白条带出现纹理现象：样品不溶性颗粒引起的。建议：加样前离心，加入适量的促溶剂。

(5)指示的澳酚蓝已跑出底板，但蛋白质未跑下来：与缓冲液和分离胶的浓度有关应更换正确PH值的缓冲液，降低凝胶浓度或使用梯度凝胶。

湿式电转印注意事项：

(1)要使蛋白质组分能有效的从凝胶转移到固相纸膜上，缓冲液的PH值很重要，有些分子量不是很大的蛋白质区带，即使延长电转印时间也不能从凝胶转移到膜上。这是由于蛋白质在转移缓冲液中恰好处于等电点状态造成的，因此应适当改变转移缓冲液的PH，以利于转膜。另外，对于分子量较小的蛋白质，可在缓冲液中加入适量甲醇，因为甲醇能促进它们固定在固相膜上。但是对于大分子量的蛋白质，尤其是碱性蛋白质，缓冲液中是不宜加入甲醇的，因为甲使凝胶孔径变小，不利于分子量较大的蛋白的转移，甲醇能将结合在碱性蛋白质上的SDS解离出来而使其带正电或呈电中性蛋白质就更难从凝胶中转移出来；

(2)电转印膜的选择：有NC膜、重氮化膜和阳离子尼龙膜，PVDF膜。其中NC膜使用的最为普遍，它的蛋白质容量大，可用各种染色方法进行检测，但是它与蛋白质的结合是非价性的，膜干燥后很脆。此外膜的孔径大小也是考虑的重要因素，目的蛋白30KD以下用0.22 um孔径的NC膜，30KD以上用0.45 um孔径的NC膜；

(3)转印选择恒流，每个转印槽150 mA，10KD以下转印40min，10-30KD转印50min，30-100KD转印70min，100kd以上转印80min，转印完毕可用丽春红S染膜检测转印是否成功，转印结束后去除NC膜置于丽春红S溶液中，室温5-10min即可看见红色条带，用TBS洗数次即可洗掉红色条带进行后续实验。

(1)电泳转膜过后，膜上其他没有结合蛋白质的空白位置需要用封闭液加以封闭，以避免一抗或二抗非特异性结合。这是由于WB的灵敏度很大程度上取决于封闭的好坏，封闭时间过长(过度封闭)导致抗原表位的遮蔽，从而降低检测灵敏度，封闭时间过短(不完全封闭)又会导致最终背景增高或信噪比太低，因此封闭液的选择和条件的优化很重要；

(2)封闭液中应加入适量的防腐剂，避免封闭蛋白变性影响封闭效果。

(1)若非特异性条带过多，可适当降低抗体的浓度，增加洗膜次数，蛋白电泳前延长变性时间，减少上样蛋白量，延长封闭时间；

(2)若信号弱，可能转膜不完全，可优化转移时间和电流，增加抗体的浓度，适当延长曝光时间；

(3 )若背景较高，可适当降低抗体的浓度，过滤二抗，延长封闭时间，增加漂洗时间，减少曝光时间。

(1)胶片曝光几秒到数分钟，具体情况要看膜上化学发光条带明暗强度而定。胶片曝光时间不宜过长，时间过长会照成胶片背景变深。冲洗胶片以确定所测抗原的正确曝光时间；

(2)冲洗胶片的步骤：曝光完的胶片先在显影液中冲洗至出现条带为止，一般在1min以内，时间过长也会照成胶片背景变深。再放入定影液中漂洗，十秒即可显影液漂洗完后，要多用清水冲洗，以免定影液中成分残留在胶片上。