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WB/ELISA/IHC三大实验,ELISA(酶联免疫吸附试验)篇(一)

做实验最怕什么?早起抢仪器?熬夜写报告?......都不是。这些是家常便饭,最怕的是辛辛苦苦做了很久的实验,才发现做出来的效果不满意,这个时候我们就需要学习一套标准的实验流程了。

IHC(免疫组化)、ELISA(酶联免疫吸附试验)、WB (免疫印迹),是免疫学三大常用工具,分别用于定位,定性和定量。



ELISA(酶联免疫吸附试验)


ELISA简介

利用抗原抗体之间专一性键结之特性,对检体进行检测;由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上之抗原抗体仍可具有免疫活性,因此设计其键结机制后,配合酵素呈色反应,即可显示特定抗原或抗体是否存在,并可利用呈色之深浅进行定量分析。

实验步骤

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ELISA(酶联免疫吸附试验)

注意事项

1、操作前应对实验的物理参数有充分的了解,如环境温度(保持在18 C~25℃)、反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等,要先查看水育箱温度,是否符合要求。

2、正确使用加样器加样器应垂直加入标本或试剂,避免刮擦包被板底部。加样过程中避免液体外溅,血清残留在反应孔壁上,加样器吸头要清洗干净,避免污染,加样次序要与说明书一致,否则可导致结果错误,实验重复性差。

3、手工洗板加洗液时冲击力不要太大,洗涤次数不要超过说明书推荐的洗涤次数,洗液在反应孔内滞留的时间不宜太长。不要使洗液在孔间窜流,造成孔问污染,导致假阴性或假阳性。

4、要保证加液量一致 我们在使用时感觉滴瓶加液不如加样器好,滴瓶不易控制加液量不准,造成显色不统一,判断错误。

5、显色液量不可过多 加样的工作环境不能处于阳光直射的环境下,加显色系统后要避光反应,显色液量不能过多,以免显色过强。

6、试剂的影响因数:应选用有国家批准文号,质量靠得住的产品,不能图便宜,忽视质量保证。试剂应妥善保存于4℃冰箱内,在使用时先平衡至室温,不同批号的试剂组分不宜交叉使用。试剂开启后要在一周内用完,剩余的试剂下次用时应先检查是否变质,,显色剂如被污染变色将造成全部显色,导致错误结果。过期的试剂不宜再用,若别无选择,应做好双份质控品的监测,确保结果的可靠性。



ELISA(酶联免疫吸附试验)

常见问题
操作前应对实验的物理参数有充分的了解,如环
问题一:景或阴性对照值偏高

可能原因建议
阴性对照孔被阳性对照或样品污染洗涤时,  勿将洗液溢出孔外
抗体非特异性结合 封闭液不适合,更换封闭液
酶结合物过浓请检查酶结合物是否按说明书规定稀释
孵育温度过高 检查孵育箱的温度是否正确、稳定
底物在使用前曝光应保存在暗处,避光
读板前停留时间过长

加终止液后3分钟内读数


问题二:标准曲线较差

可能原因建议
标准瓶溶液配置有误确认是否进行正确稀释
标准品复溶不当 开盖前进行离心;检查复溶是否存在不溶物
标准品已降解按推荐方式保存和处理标准品
曲线的标度不合适 尝试使用不同标度绘制曲线,例如双对数、5参数拟合
移液器加样误差正确使用经过校准的移液器


问题三:标准曲标准曲线良好,但样本无检测信号
可能原因建议
样本中无检测物或检测物含量极低设置内参, 重新实验
样本中其他物质影响/掩盖检测  作适当稀释,降低其他物质的干扰,或作系列稀释,检测回收率
样本中检测物浓度过高,Hook效应导致假低值适当倍数稀释样本,检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内


问题四:显色缓慢
可能原因建议
样本未置于室温 实验开始前,将样本平衡至室温
酶结合物活性减弱 检测稀释度
酶活性收到抑制如叠氮钠 避免实验不当的防腐剂
显色温度不适当按说明书操作



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