产品及特点:
易错 PCR(error-prone PCR)是利用 Taq DNA 多聚酶不具有 3′→5′校对功能的特性,在一定条件下(如不同的 dNTP 浓度、Mg 浓度和MnCl2 存在)能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法,则可从构建的突变库选出所需突变体。易错 PCR 和常规 PCR 的比较如下:
本产品就是专门为广大的研究工作者进行易错 PCR 而开发,
本产品具有下列特点:
1. 即开即用,十分简单方便,尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
2. 配方经过精心优化,突变率稳定,突变没有趋向性。易错 PCR 的突变率为 0.66%(± 0.13%),详见使用手册疑难解答。
3. 比体内基因突变更快捷简单,但如果在 PCR 引物中设计位点,则可使产物克隆到表达载体,也可以用于体内蛋白活性的筛选。
4. 可用于连续易错PCR(sequential error-prone PCR),只需把上一次易错PCR 的产物用作下一次易错 PCR 的模板即可,使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
5. 只适用于扩增 1kb 以下的产物,对于 1kb 以上的产物,建议分段扩增。
6. 本产品足够 100 次 30uL 体系的易错 PCR 反应,只能用于科研。
规格及成分:
成 份 | 编 号 | 十孔盒包装 |
易错 PCR Mix,10× | 试剂一 | 300 uL(白盖 |
易错 PCR 专用 dNTP,10× | 试剂二 | 300 uL(绿盖 |
易错 PCR 专用 MnCl2 | 试剂三 | 300 uL(黄盖 |
易错 PCR 专用 Taq DNA 聚合酶(5U/uL) | 试剂四 | 50 uL(红盖 |
使用手册 | 1 份 |
运输及保存:低温运输,-20℃保存, 有效期为一年。
自备试剂:引物、DNA 模板、超纯水。
使用方法:
1. 将自备的 PCR 引物稀释到 10uM。引物也是决定易错 PCR 成败的关键因素,设计引物时要保证其 Tm 在 70℃,长度在 25-30nt 之间,GC 含量在 45%-60%之间,3端 GC 含量低,并且没有发夹结构。
用自备引物和常规 PCR 试剂扩增制备易错 DNA 模板(常规 PCR 产物),胶回收并准确确定浓度。注意:易错 PCR 的模板一定要用胶回收的常规 PCR 产物,因为胶回收会可以把电泳不可见的非特异性扩增片段去除,否则这些片段由于也是用易错 PCR 引物扩增所得,在易错 PCR 扩增时也会被扩增,产生竞争抑制,降低靶分子的扩增效率。如果常规 PCR 制备模板的引物和易错 PCR 引物不同(类似巢式 PCR)则可以避免此问题,但需要合成两对引物。本试剂盒只适用于扩增 1kb 以下的产物,对于 1kb 以上的产物,建议分段扩增。
2. 将回收的 DNA 片段(模板)稀释到 1ng/uL 、10ng/uL 和 100ng/uL 三个浓度。注意:模板使用量是影响突变率的最重要因素,模板 DNA 为非突变 DNA,扩增产生的 DNA 为突变 DNA,易错 PCR 体系最终 DNA 量是基本固定的,因此模板 DNA使用量越大,则突变 DNA 在终产物中的相对比例就越低,突变率就越低。反之亦然。但模板太少又不容易扩增成功,所以建议同时测试三个模板用量。如果都成功,则优 先选用模板浓度低的 PCR 产物进行分析。
3. 以 30 uL 的标准 PCR 反应体系为例,如果反应体系不是 30 uL,各成分需要等按比例增加或减少。在一干净的 PCR 管中,
加入下列成分:
4. 按用户已经优化的 PCR 条件进行一定循环数的 PCR(循环数与突变率的关系见下表),然后取 10uL 电泳检查。如果没有优化的 PCR 条件,一般可以先尝试下面的 PCR 条件(注意:易错 PCR 一般不需要热启动,也不需要在 PCR 结束后做延伸处理):
步骤 | 参数 | 循环数 |
PCR 前变性 | 94℃ 3 分钟 | 循环 1 次 |
易错 PCR | 94℃ 1 分钟 |
循环 30-60 次 |
45℃ 1 分钟 | ||
72℃ 1 分钟 |
注:易错 PCR 一般不需要热启动,也不需要在易错 PCR 结束后做延伸处理。易错 PCR 循环次数越多,突变 DNA(扩增产物)与非突变 DNA(原始模板)的比例就越高。此外在突变率和模板长度恒定的情况下,扩增次数越多,发生突变的绝对数就越高,在同一模板上发生的突变 位点数就越多,所以如果需要,可以做 30、35、40、45、50、55、60 次 7 个循环数的比较。
5. 电泳检测是否得到预计长度的 PCR 产物。如果没有,可以调整模板用量和 PCR 参数。
胶回收易错 PCR 扩增产物、克隆并对单菌落进行功能筛选或测序分析、如果需要增加突变率,可以以突变后的 DNA 为模板,进行下一轮易错 PCR。
注意事项:该产品仅供科研实验使用,未经允许不得用于其它用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。