RealFast EcoRI快切酶

● 储存条件：

  -20℃保存

● 产品简介：

    RealFast制性内切酶是经过基因工程重组，能够在 5-15分钟之内快速剪切 DNA 的快速酶。所有RealFast系列限制酶都适用于通用的反应缓冲液，可以在同一个反应体系内任意组合，无需多次单酶切或更换酶切缓冲液。该系列限制性内切酶均经过多个严格的质控环节，适用于质粒 DNA、PCR 产物或基因组 DNA等的快速酶切。

●活性定义：

37°C下，在 20 μl 反应体系中，1 μl酶能够在15分钟内完全消化1 μg λ DNA。

●热失活条件

   80°C温育20 分钟。

● 质量控制：

1. 超长时间温育/星号活性  (Star Activity) 检测：

将1 μl RealFast EcoRI与1 μg λ DNA  共温育1小时后，并未检测到由于其他核酸酶污染或星号活性而引起的底物非特异性降解。但更长时间的温育有可能出现星号活性。

2. 酶切-连接-再酶切检测：

使用 10 倍酶量消化底物，回收酶切产物。在22℃下使用适量T4 DNA连接酶可以将超过95%的酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开超过95%的连接产物。

3. 外切酶活性检测：

在 50 μl反应体系中，使用 10倍酶量与1 μg超声波断裂的 ³H标记 DNA (10⁵ cpm/μg)  片段在37℃下温育4小时后，释放出<0.1%的放射性。

4. 非特异性内切酶活性检测：

使用10倍酶量与1 μg超螺旋质粒DNA共同温育4 小时后，使用琼脂糖凝胶电泳检测，质粒 DNA仍然处于超螺旋状态。

5. 蓝白斑检测：

    将含有单一lacZα基因的载体以10倍酶量消化，重新连接后转化入大肠杆菌感受态细胞，涂布在含有对应抗生素、 IPTG和X-gal的LB培养基平板上。连接正确的产物会生长出蓝色菌落，而连接错误（即DNA末端切口不完整）的产物将得到白色菌落。对于 RealFast系列限制酶而言，白色菌落比例应小于 1%。

● 使用说明：

一. DNA快速酶切流程：

1. 在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系：

*本体系适用于经过纯化的PCR 产物酶切。未纯化的 PCR 产物具备一定的离子强度，10×RealFast buffer加入量可适当减少至 2 μl。但由于 DNA聚合酶同时具有外切酶活性，会影响酶切产物，因此如下一步需进行克隆等操作，建议酶切前对PCR产物进行纯化。

2.  轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心以收集挂壁液滴；

3. 37℃温育15 分钟（质粒），或15-30 分钟(PCR产物），或 30-60 分钟（基因组 DNA）；

4. 80℃温育 20分钟即可使酶失活，停止反应（可选） 。

二. 双酶切或多酶切：

1. 每种酶的用量为 1 μl，并根据需要适当扩大反应体系。

2. 所有酶的体积总和不得超过总反应体系的1/10。

3. 如果所用的限制酶要求的最适反应温度不同，应先以最适温度较低的酶开始酶切，再添加最适温度较高的酶，以较高的温度进行温育。

三. 适用于质粒的扩大反应体系

注意：如果总反应体系大于20 μl，应适当增加温育时间。

四. 甲基化修饰影响

五. 在不同反应缓冲液中的活性