植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)测定试剂盒
产品简介: 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCase)是 C4 植物和CAM 植物固定CO2的关键酶,催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸,在植物和细菌中广泛存在,在动物及丝状霉菌中缺乏此酶。此酶是变构酶,主要功能为三羧酸循环提供草酰乙酸, 另外也与 C4 植物光合二氧化碳固定反应及景天科植物的苹果酸形成 (景天酸代谢 )等有关。 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPCase)检测试剂盒检测原理如下:在弱碱条件下,PEPCase 催化 磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和CO2形成草酰乙酸(OAA);OAA 在苹果酸脱氢酶(MDH)催化下被 NADH 还原为苹果酸 (Mal) 。在碱性条件下每吸收 1 分子 CO2伴随 1 分子 NADH 氧化,通过分光光度计测定处吸光度的变化,计算出 NADH 的消耗速率,进一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性水平。 该试剂盒主要用于检测植物样本中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性。该试剂盒仅用于科研领域,不宜用于临床诊断或其他用途。 按照一次使用1 ml 提取缓冲液计算,试剂盒可以使用100次。 ● 自备材料: 植物材料;剪刀;液氮;研钵或其他研磨设备;1ml石英比色皿;紫外分光光度计;制冰机;低温离心机 ● 操作步骤: 一、 即用型PEPCase提取缓冲液配制: 一个反应配制体积 n个反应配制体积 1 ml n×1 ml PEPCase提取缓冲液(2×) 500 μl n×500μl 灭菌水 470 μl n×470 μl 1 M DTT(100×) 10 μl n×10 μl BSA溶液50mg/ml 20 μl n×20μl 注:1. 即用型PEPCase提取缓冲液尽量现配现用,短期4℃中可以过夜保存。 二、 PEPCase样品提取: 1. 取新鲜植物组织,清洗干净,擦干,液氮中研磨,1 cm2叶片(1分硬币大小)或0.1g叶片粉末加入1 ml 即用型PEPCase提取缓冲液,颠倒混匀,冰浴放置5-10分钟。 2.12000g4℃离心 5分钟,上清即为PEPCase提取液,冰浴放置备用。 注:提取液最好立即测定,不建议保存。 三、PEPCase活性测定分析: 1. 即用型酶溶解缓冲液配制: 按照标签所示,在试剂6-酶溶解缓冲液原瓶中加入1.5 ml灭菌水和1 ml BSA溶液(50mg/ml),混匀后即配成即用型酶溶解缓冲液,冰浴备用,-20℃保存。 2. 试剂3-PEP:按照标签所示加入灭菌水,彻底混匀后冰浴备用。 3. 试剂4-NADH:按照标签所示加入灭菌水,彻底混匀后冰浴备用。 注:NADH稳定性较差,用后-20℃贮存3-4天,长期-80℃保存。 4. 试剂5-MDH:按照标签所示加入即用型酶溶解缓冲液,彻底混匀后冰浴备用。 5. 反应体系设定: 加入顺序 组份 1ml反应体系加入量 (测定1个样品) MasterMix配制 (测定n个样品为例) 1 10×PEPCase Assay Buffer 100 μl n×100 μl 2 灭菌水 870 μl n×870 μl 3 NADH溶液(100×) 10 μl n×10μl 4 PEP溶液(100×) 10 μl n×10 μl 5 MDH溶液(100×) 10 μl n×10 μl 5. 反应体系测定; 1.5 ml离心管中配制以下反应 1 2 对照反应 样品活性测定 MasterMix 975 μl 975 μl 即用型PEPCase提取缓冲液(步骤一) 25 μl - PEPCase样品提取液 (步骤二) - 25μl 混匀后加入到1 ml比色皿中,立即计时,此时吸光度为A0,每隔 10s 测定一次吸光度,其中至 1min 时处吸光度记为 A1,记录其变化。 注意: = 1 \* GB3 ① 一般分光光度计OD340读数在0.5-3之间数据比较准确,低于此范围说明提取用的材料太少,酶活性太低;高于此范围说明所用材料太多,酶活性太高,此时可以将PEPCase样品提取液用即用型PEPCase提取缓冲液稀释后测定。 = 2 \* GB3 ② 该反应系统是利用速率变化,求得相应 OD 的变化,进而推算出 NADH 的消耗速率,再进一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的量。 因此加入PEPCase样品提取液后立即计时很重要,每次检测指标不宜过多,否则有可能由于操作时间有差异进而导致结果偏差。 四、PEPCase活性计算: 根据如下公式计算样品中PEPCase活性: 1. 根据叶片面积的计算公式: Activity(μmol·m-2·S-1)= Activity(μmol·m-2·S-1)-表示每秒每平方米叶片有多少μmol NADH被氧化 △A-反应最初1分钟内340nm处测定管吸光度变化的绝对值,△A=A0-A1 N-稀释倍数,本程序中为40(1 ml提取液,取25μl测定)。 6.22-每微摩尔NADH在340nm处的吸光系数 d-cm 比色皿光程,一般为1 △t-秒 测定时间,本程序为60秒 S-cm2 提取时使用的叶面积 2. 根据叶片鲜重的计算公式: Activity(μmol·g-1·S-1) Activity(μmol·g-1·S-1)-表示每秒每克鲜重叶片有多少μmol NADH被氧化 △A-反应最初1分钟内340nm处测定管吸光度变化的绝对值,△A=A0-A1 N-稀释倍数,本程序中为40(1 ml提取液,取25μl测定)。 6.22-每微摩尔NADH在340nm处的吸光系数 d-cm 比色皿光程,一般为1 △t-秒 测定时间,本程序为60秒=