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T4 DNA ligase
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● 产品简介：
T4 DNA Ligase 是从表达T4 DNA Ligase 基因的大肠杆菌经诱导表达后分离纯化而来的，催化相邻DNA链的5’磷酸基团和3’羟基基团以磷酸二酯键结合反应。该酶可催化平末端或粘性末端DNA之间的连接，还可修复双链DNA、RNA、DNA/RNA杂交双链中的单链切口。本品可应用于DNA插入片段和载体DNA的粘性末端和平末端的连接，以及线性DNA的自身环化。
活性定义：此酶的活力单位为Weiss Unit。1个Weiss Unit相当于约200个粘性末端连接单位（cohesive-end ligation unit, CEU）。1个CEU单位定义为在20 μl的连接反应体系中，在16℃30分钟内，能使50%的经HindIII消化的λDNA片段连接所需的酶量。
● 注意事项
1．T4 DNA Ligase的最终用量不要超过推荐的用量，否则影响连接效率。
2．PEG可以极大提高平末端的连接效率，我们推荐加入终浓度为5% PEG Solution以提高平末端的连接效率。
3．为了提高转化效率，转化时建议所加入连接产物的量不要超过感受态细胞体积的10%。
4．由于T4 DNA Ligase中含有甘油，比较粘稠容易挂壁，建议使用前短暂离心将液体收集到管底，取样时枪头尽量不要深入液面太深以免粘在枪头上造成损失。
● 使用方法：
一 DNA片段和载体DNA的连接
1）粘性末端的连接
1．反应体系:
10μl体系 | 终浓度 | |
线性载体DNA | x μl | 10-50 ng |
插入DNA片段 | y μl | 插入片段：载体=1:1-5:1* |
10×ligation buffer | 1 μl | 1× |
T4 DNA ligase(5U/μl) | 0.1 μl | 0.5 U |
ddH2O | up to 10 μl |
*：载体与插入片段的摩尔数比需要优化：一般vector:insert在1:1~1:5之间均可得到较好的结果。用以下公式计算片段摩尔数：pmol数= DNA量(ng)/(660×片段bp数)×1000。例如：插入片段2000bp，线性载体为3000bp，如果载体使用量为50ng（0.025pmol），10μl连接体系中vector:insert的摩尔比是1:3，则需要2000bp pmol数为0.075pmol，插入片段2000bp的使用量为100ng。
2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
3．反应条件：16℃孵育30分钟。
4．可取5 μl连接产物热击转化50 μl感受态细胞或取1-2 μl连接产物电击转化50 μl感受态细胞。
注：1）若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒对连接后的DNA片段进行纯化后进行电击转化。
2）若要提高转化子数目，可将连接时间延长至1小时。
3）在10 μl连接体系中若T4连接酶的终浓度大于1 U，必须对连接后的DNA片段进行纯化后方可进行电转。
2）平末端的连接
1．反应体系:
10μl体系 | 终浓度 | |
线性平末端载体DNA* | x μl | 10-50 ng |
插入DNA片段 | y μl | 插入片段：载体=1:1-5:1** |
10×ligation buffer | 1 μl | 1× |
T4 DNA ligase(5U/μl) | 0.5 μl | 2.5 U |
50% PEG solution | 1 μl | 5% |
ddH2O | up to 10 μl |
*：平滑末端的载体与 DNA 片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。
**：载体与插入片段的摩尔数比需要优化：一般vector:insert在1:1~1:5之间均可得到较好的结果。用以下公式计算片段摩尔数：pmol数= DNA量(ng)/(660×片段bp数)×1000。例如：插入片段2000bp，线性载体为3000bp，如果载体使用量为50ng（0.025pmol），10μl连接体系中vector:insert的摩尔比是1:3，则需要2000bp pmol数为0.075pmol，插入片段2000bp的使用量为100ng。
2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
3．反应条件：16℃孵育30分钟。
4．可取5 μl连接产物热击转化50 μl感受态细胞或取1-2 μl连接产物电击转化50 μl感受态细胞。
注：1）由于平末端连接体系中，T4 ligase用量较大，若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒或氯仿抽提对连接后的DNA片段进行纯化后才能进行电击转化。
2）若要提高转化子数目，可将连接时间延长至1小时。
二 线性DNA的自身环化
1．反应体系:
50μl体系 | 终浓度 | |
线性载体DNA | x μl | 10-50 ng |
10×ligation buffer | 5 μl | 1× |
T4 DNA ligase(5U/μl) | 1 μl | 5 U |
ddH2O | up to 50 μl |
2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
3．反应条件：16℃孵育30分钟。
4．可取5 μl连接产物热击转化50 μl感受态细胞或取1-2 μl连接产物电击转化50 μl感受态细胞。
注：1）若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒或氯仿抽提对连接后的DNA片段进行纯化后才能进行电击转化。
三 接头连接
1．反应体系:
20μl体系 | 终浓度 | |
线性DNA | x μl | 100-500 ng |
磷酸化接头 | y μl | 1-2 μg |
10×ligation buffer | 2 μl | 1× |
50% PEG solution | 2 μl | 5% |
T4 DNA ligase(5U/μl) | 0.4 μl | 2 U |
ddH2O | up to 20 μl |
2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
3．反应条件：16℃孵育30分钟。
4．65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟灭活T4 DNA Ligase。连接产物可以直接进行限制性内切酶酶切反应。