动物/细胞基因组DNA提取试剂盒
● 试剂盒内容及保存:
试剂盒组成 | HZG5402-02 (50次) | HZG5402-02 (100次) | 贮存方式 |
缓冲液GA | 15 ml | 30 ml | 室温 |
缓冲液GB | 15 ml | 30 ml | 室温 |
去蛋白液GD(浓缩液) | 18 ml | 36 ml | 室温 |
漂洗液PW(浓缩液) | 25 ml | 25ml | 室温 |
洗脱缓冲液EB | 15 ml | 15 ml | 室温 |
蛋白酶K(20 mg/ml) | 1ml | 2×1ml | -20℃ |
RNase A(10 mg/ml) | 0.5 ml | 1 ml | -20℃ |
吸附柱CG | 50个 | 100个 | 室温 |
收集管(2 ml) | 50个 | 100个 | 室温 |
说明书 | 1份 | 1份 |
● 储存条件和效期:
本试剂盒在室温(25℃左右)干燥条件下,可保存1年;更长时间的保存可置于2–8℃。2–8℃保存条件下,若溶液产生沉淀,应在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。单独包装的蛋白酶K和RNaseA收到后最好按照需要分装成小管,-20℃保存。
● 产品简介:
本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统,能提取多种细胞/组织中的基因组DNA。离心吸附柱可以高效、专一吸附DNA,可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大,纯度高,质量稳定可靠。
使用本试剂盒回收的DNA可适用于各种常规操作,包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。
● 提取得率:
材料 | 提取量 | DNA得量 |
动物细胞培养液 | 106–107 cells | 5–30 μg |
动物组织 | 30 mg | 10–30 μg |
● 准备工作:
1. 准备55℃和70℃水浴;无水乙醇;1.5ml灭菌离心管。
2. 按照标签所示在去蛋白液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇,混匀后盖紧瓶盖后室温贮存备用。
3. 每次使用前请检查缓冲液GA,缓冲液GB和去蛋白液GD是否有沉淀生成,如果出现沉淀,37℃温浴至沉淀溶解后再使用。
● 操作步骤:
如非指出,所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
1. 处理材料:
a. 培养细胞:贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液(如用PBS缓冲液或类似缓冲液),10,000 g离心1分钟,倒尽上清,加入200 μl缓冲液GA,振荡至彻底悬浮。
b. 组织:取约30mg动物组织(脾组织用量应少于10 mg)加入到事先盛有200μl 缓冲液GA的1.5ml离心管中,用研磨杵彻底将组织研碎。
2. 加入20 μl蛋白酶K (20 mg/ml)溶液。
a. 提取细胞基因组时,加入蛋白酶K混匀后,55℃放置5-10分钟。
b. 提取组织基因组时,加入蛋白酶K混匀后,在55℃放置,直至组织溶解。
注:不同组织裂解时间不同,通常需1-3小时即可完成(鼠尾需要消化过夜),期间间歇颠倒混匀样品。
3. 加入10 μl RNaseA(10 mg/ml)溶液,混匀后室温放置2分钟。
4. 加入220 μl缓冲液GB,充分颠倒混匀,70℃放置10分钟,溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠。
注:加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀,一般70℃放置一段时间后会消失。如溶液未变清亮,说明细胞裂解不彻底,会影响DNA的纯度和得率,而且可能导致步骤6中离心柱堵塞。
5.加入220 μl 无水乙醇,颠倒混匀,简短离心以去除管盖内壁的水珠。
注:加入乙醇后会产生絮状沉淀,可用枪头反复抽打1-2次将沉淀弄碎后再上柱。如果絮状物未做处理,容易导致步骤6中离心柱的堵塞。
6.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CG中(吸附柱放入收集管中),11,000g离心2分钟,倒掉废液,吸附柱CG放回收集管中。
注:如果出现吸附柱堵塞现象,可将离心时间延长到5分钟。
7.向吸附柱CG中加入500 μl去蛋白液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),11,000g离心1分钟,倒掉废液,吸附柱CG放入收集管中。
8.向吸附柱CG中加入700 μl 漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),11,000g离心1分钟,倒掉废液,吸附柱CG放入收集管中。
9.向吸附柱CG中加入500 μl 漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),11,000g离心1分钟,倒掉废液。
10.将吸附柱CG放回废液收集管中,11,000g离心2分钟。
注:此步骤非常重要,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。
11.将吸附柱CG转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加100 μl经70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB,室温放置2分钟,11,000g离心2分钟。
注;1. 洗脱缓冲液体积最好不少于100 μl,体积过小影响回收效率。
2. 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内,pH值低于7.0会降低洗脱效率。
12. DNA产物-20℃保存。