RealPure普通植物RNA提取试剂盒
● 试剂盒内容及保存:
试剂盒组成 | HZR5302-S (5次) | HZR5302-01 (50次) | 贮存方式 |
裂解液RL | 5 ml | 30 ml | 常温 |
裂解液RL plus | 3 ml | 30 ml | 常温 |
去蛋白液RD | 3 ml | 30 ml | 常温 |
漂洗液RW(浓缩液) | 1.5 ml 首次使用按照标签加入无水乙醇 | 25 ml 首次使用按照标签加入无水乙醇 | 常温 |
RNase-free水 | 1 ml | 5 ml | 4℃ |
DNA清除柱CS(RNase-free) | 5个 | 50个 | 常温 |
RNA吸附柱CR(RNase-free) | 5个 | 50个 | 常温 |
收集管 | 10个 | 100个 | 常温 |
2 ml离心管(RNase-free) | 5个 | 50个 | 常温 |
1.5 ml离心管(RNase-free) | 15个 | 150个 | 常温 |
说明书 | 1份 | 1份 |
● 储存条件和效期:
RNase-free水4℃保存;其他试剂在常温(25℃左右)干燥条件下,可保存1年。试剂盒常温运输。
● 产品简介:
本试剂盒可从普通植物(拟南芥,水稻,小麦,烟草,玉米,绿萝等)叶片、茎、幼苗、果肉中快速提取总RNA,可同时处理大量不同样品,20-30分钟内即可完成反应,提取的总RNA纯度高,没有DNA和蛋白的污染,可用于Northern blot、Dot blot、polyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等实验。
由于植物材料的复杂性,该试剂盒不能提取多糖多酚植物RNA,也不能有效提取植物种子、块茎、鳞茎的RNA,提取这些材料的RNA请选择RealPure多糖多酚植物RNA提取试剂盒(Cat:RTR2304)和RealPure植物种子RNA提取试剂盒(Cat:RTR2308)。
● 准备工作:
1操作前在裂解液RL中加入β-巯基乙醇至终浓度1%,如500 μl RL中加入5 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的 RL4 ℃可放置3天。
2 按照标签所示在漂洗液RW中加入无水乙醇(自备),混匀后盖紧瓶盖后室温贮存备用。
3 所有离心步骤均在常温下进行。
● 操作步骤:
1. 样品处理:
1.1 1.5 ml离心管中加入500 μl裂解液RL(使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇)。
注:多糖多酚植物(如银杏,毛白杨等)使用该试剂盒不能提取RNA,请选择RealPure多糖多酚植物RNA提取试剂盒(Cat:RTR2304)。
背景知识:快速判断是否为多糖多酚植物
取20mg左右的植物材料,放入1.5 ml离心管中,加入0.5 ml 0.2 M NaOH溶液,95℃ 10分钟,观察裂解物颜色。颜色为绿色或淡黄色为普通植物;颜色为棕黄色或棕红色为多糖多酚植物。
1.2将植物材料加入到液氮预冷的研钵中,用研杵研磨,其间不断加入液氮,直至研磨成粉末状。取50 mg粉末迅速加入到离心管中,涡旋剧烈震荡混匀,常温放置5分钟。
注:一定不要加入超过50 mg的粉末,否则样品超过裂解液RL的裂解能力会导致RNA提取失败。
背景知识:样品处理量绝对不要超过RNA吸附柱处理能力,否则造成RNA残留或者产量降低。不同植物组织种类RNA相差极大,例如有些植物种子RNA含量较高,玉米种子RNA含量可达50 μg/50 mg种子,超过50 mg材料会超过吸附柱吸附能力,导致提取失败。所以开始摸索实验条件时,如果不清楚样品RNA含量时宁可使用较少的样品处理量,如植物组织不超过50 mg,随后根据实验结果增加或者减少处理量。
2. 离心取上清:
13,000 rpm离心5 min,小心吸取收集管中的上清至1.5 ml RNase-free的离心管中,吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。一般可获得400 μl上清。
3. 去除基因组污染:
上清中加入0.5倍体积的无水乙醇(如400 μl上清中加入200 μl无水乙醇),混匀(此时可能会出现沉淀),得到的溶液和沉淀一起转入DNA清除柱CS(清除柱放入收集管中)中,13,000 rpm离心2分钟,弃掉收集管中的废液。
注:确保全部溶液都收集到收集管中,如果膜上有残留液体,延长离心时间至5分钟,保证膜上无残留液体。
4. 洗脱RNA:
将DNA清除柱放入一干净的2 ml离心管中,在清除柱中加入500 μl 裂解液RL plus,13,000 rpm离心1分钟,收集滤液(注意:RNA在滤液中,不要丢弃),滤液中加入250 μl无水乙醇,此时可能会出现沉淀,立即混匀,不要离心。
5. RNA挂柱:
将全部溶液加入到RNA吸附柱CR中(吸附柱放入收集管中),13,000 rpm离心2分钟。
注:确保溶液全部过滤到收集管中,膜上无残留,如有必要,可以延长离心时间至5分钟。
6. 去除RNA中的蛋白污染:
向RNA吸附柱CR中(吸附柱放入收集管中)加入500 μl 去蛋白液RD,13,000 rpm离心1分钟,弃废液。
7. 去除RNA中的其他杂质:
向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇), 13,000 rpm离心1分钟,弃废液。
8. 进一步去除RNA中的其他杂质:
向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW (使用前请先检查是否已加入乙醇),13,000 rpm离心1
分钟,弃废液,将吸附柱CR放回收集管中,确保盖好吸附柱管盖。
9. 关键步骤:彻底去除吸附柱上的残余乙醇:
13,000 rpm将吸附柱CR空甩离心2 分钟,去除吸附柱上的残余液体。
注:此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,如果有漂洗液残留,可能会影响后续的RT等实验操作。
10. 洗脱得到RNA:
将RNA吸附柱CR转入一个新的1.5 ml RNase-free离心管中,向吸附柱O型垫圈中央悬空加入50-100 μl RNase-free水(事先65℃预热可提高洗脱效率),盖好吸附柱管盖,常温放置2分钟,13,000 rpm离心2 分钟