mRNA Realtime qPCR (实时荧光定量) 实验服务

一、荧光定量PCR概述

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法，而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。

随着分子生物学技术研究的不断进展，定量PCR技术取得了突飞猛进的发展，实时定量PCR (real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术。所谓实时定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。

　　目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，仅 2000-2001年，收录在Medline上的以real-time PCR为关键词的文章就达1000多篇。实时PCR技术较之以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。

　 　实时荧光定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实 时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差，提高实验的重复性。该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的 mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果。

为您提供全套实时荧光定量PCR技术服务，全部实验皆进行品质保证；实验结束后，可以提供客户完整的实验数据；并可以有一次免费的技术培训。

 mRNA QPCR  检测使用的仪器 进行检测使用的主要仪器为QPCR， 使用life technology最新款的ViiA™ 7实时荧光定量PCR系统进行microRNA的QPCR 检测。 

ViiA™ 7实时荧光定量PCR系统在单一的高性能仪器上融合了您需要的所有实时荧光定量PCR特性，从而帮助您优化研究效率。ViiA™7系统具有简单的工作流 程、直观的软件、触控屏界面以及使误操作降至最少的单键实验方案，可提供出众的重复性和最小的孔间和仪器间差异。

产率
ViiA™ 7系统适用于中等至高通量实时荧光定量PCR，可提升您的实验室效率。
快速的加热块更换——前开门设计使热循环加热模块的更换变得更容易，无需移动旁边的设备，如机械臂或计算机
简单的触摸屏界面——仪器触摸屏提供了一键式实验方案，可快速简单地完成各种应用Assay的设置
自动化兼容性——ViiA™ 7系统结合了Applied Biosystems® Twister® II 机器人，使您在自动化环境下实现效率最大化

整合
可与TaqMan® Array微流体芯片和 Applied Biosystems® TaqMan® Assay完全兼容：实时荧光定量PCR分析的金标准，具有高灵敏度、高特异性和宽动态范围。
384 孔通量且无需机器辅助——采用TaqMan® Array微流体芯片，无需移液机器人或复杂的移液装置；只需加入您的样本和预混液，即可在ViiA™ 7系统上运行
与全套 TaqMan® Assay 兼容——ViiA™ 7系统已经过优化，可用于所有TaqMan® Assay(包括 MicroRNA、蛋白质、非编码 RNA 和Pri-miRNA Assay)，从而获得清晰简洁的数据

性能
ViiA™ 7系统具有下列特点：
OptiFlex® 系统——增强型荧光检测，可实现准确且灵敏的数据分析
最大程度的多重分析能力——6 个可自由组合的激发和发射滤光片通道，可实现最多的染料组合和最大的多重反应能力
灵活的数据采集——多种升降温方法检测形式为升降温阶段的荧光数据采集提供了更多的灵活性
精确定量——在单色反应中可检测出低至1.5倍的拷贝数差异

ViiA™ 7软件具有：
直观的界面和创新的设计
便捷的自动化操作
更强大的数据分析
与高通量完全兼容

可扩展的软件构架
提供可选的附加性能，可升级至现有软件。
遵循美国联邦法规第21章第11节(21 CFR Part 11)——可选的SAE模块，提供记录安全、审计和电子签名信息，从而实现全方位的数据可追溯性
高分辨率熔解曲线(HRM)——采用内置的MeltDoctor™ 实验方案和校准，您可以缩短优化运行的时间，从而将更多的时间用于分析您的结果。通过方便的软件设置即可根据需要设置基因型种类的数目。

仪器

二、荧光定量化学原理介绍

 目前比较主流的有两类，一类是特异性荧光探针法，以taqman 荧光探针为代表；

 一类是非特异的荧光染料法，这个以sybgreen 染料为代表。

☆TaqMan荧光探针
　 　PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告 基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统 可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如图所示。

 ☆SYBR Green荧光染料
　　SYBR Green是一种DNA结合染料，能掺入到双链DNA中去。在游离状态下，它不发出荧光，但一旦结合到双链DNA中以后，便可以发出荧光。它的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合，用于任意反应体系中。

 染料法的特点：经济。因为可以通用，荧光染料PCR的使用成本比探针的价格要便宜得多。

但由于染料能与所有的双链DNA结合，所以一旦反应体系中出现非特异扩增，那它就会影响到定量结果的可靠性与重复性。要避免这种不利因素，需要结合熔解曲线来判断产物的特异性，并通过选择良好的引物并优化反应条件以消除非特异性影响。采用sybr green 荧光染料法进行real time PCR 实验，最重要的是熔解曲线和扩增曲线结合起来进行判断。

三、 QPCR mRNA检测服务样品准备   ◇ 足量的并且保证纯度的细胞或组织
   注意：QPCR mRNA 检测的样本取样同Real time PCR  microRNA的组织取样与保存：1、 取动物的组织，动作要求迅速，尽量避免样本在环境中暴露太久；2、 讲样本迅速放入无菌无酶的冻存管中，为保证质量，推荐选取Axygen，corning，nunc等国外品牌的冻存管；3、 在冻存管上做好标记，尽量清晰易辨；在实验记录本上做好记录，尽量详细易查；4、 将冻存管直接放入液氮中速冻；或加入1ml Trizol 到冻存管中，再放入液氮速冻；5、 速冻2h 后，将冻存管从液氮转至-80度冰箱，可以保存6个月左右；QPCR mRNA 检测的样本取样同Real time PCR  microRNA的细胞取样与保存1、 悬浮细胞：500g 离心5min 取细胞，用PBS 清洗2-3遍，得细胞，并转至放入冻存管中；2、 加入1ml Trizol 到冻存管中，吹打混匀；3、 在冻存管上做好标记，尽量清晰易辨；在实验记录本上做好记录，尽量详细易查；4、 将冻存管放入液氮速冻，2h 后，转至-80度冰箱，可以保存6个月左右；尽量及早提取组织或细胞样本中的RNA并逆转录为cDNA，因为即使冻存，降解仍然存在。样本运输：液氮运输 四、mRNA 检测技术服务标准流程：1、 客户提供样本（组织，细胞或者RNA)，请参照取样与保存；2、 客户提供检测指标；3、与客户协商内参的选取（人，大鼠，小鼠均有两种内参可以采用）；4、客户样本验证进行抽提，特异性逆转录，QPCR 检测，验证系统是否好用；5、 客户的大批量样本进行处理，抽提和实验。 实验对象为组织样品，组织量不是很少的情况下，可以采用trizol 法进行抽提。取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。
实验对象为细胞样品，细胞数量不是很少的情况下，可以采用trizol 法进行抽提。每份样品取1×10⁶～1×10⁷细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。

 6、 RNA 特异性逆转录得到内参CDNA， 对样本的质量进行验证；

7、 大批量样本real time PCR实验；使用仪器为：ABI 公司的Vii7； 8、 靶基因表达水平结果分析，数据分析方法为：delta delta CT 法；也可以采用相对定量的标准曲线法； 9、 提供客户实验报告；包括方法，材料，设备，原始数据和计算数据的成套材料； 

五、 real time PCR mRNA检测技术服务收费标准
 

本产品仅供科研使用。不能用于人和动物治疗等其它临床诊断使用！