microRNA qPCR 实验服务

一、简介： 关于microRNA

    是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由21－25个核苷酸组成。这些小的miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达。成熟的microRNA 的形成包含多个步骤。首先，microRNA 基因被转录成命名为pri-microRNA 的初级转录物；动物pri-microRNA的第一次剪切位于细胞核内，产生大小为70个核苷酸左右并能形成茎-环结构的microRNA 前体，称为pre-microRNA；第二次剪切位于细胞质中，pre-microRNA被剪切成21-25个核苷酸成熟的microRNA。

     MicroRNA 自从1993年首次被报道以来，现已经被发现了3000多种，存在于人类和所有的模式生物中。MicroRNA 通过与mRNA的3’ UTR 结合而介导翻译水平的调控，也可通过与mRNA结合的互补程度决定microRNA将以何种机制发生作用；完全的互补引起与RNAi类似的作用，不完全互补则导致翻译抑制作用。因此，研究microRNA对于深入探讨生命现象的本质，解释细胞行为和疾病发生机制，具有重要的理论意义；对于疾病的诊断、治疗和预防具有潜在的实际应用价值。

    _{关于microRNA：}

图１，pre-microRNA 和 microRNA 示意图

MicroRNA由于长度太短，一般难以检测。

二、BioTNT miRNA qPCR Detection System 介绍

BioTNT 生物技术部推出了 miRNA qPCR Detection System ， 是专门用于miRNA 定量检测的系统。该系统包括：

·                 miRNA检测试剂盒miRNA qRT-PCR Detection Kit:

• 应用于miRNA的特异茎环逆转录系统、及其qPCR 反应特异miRNA的引物assay：

• 特异性的茎环逆转录引物和qPCR检测上下游引物。

特点：

• 1.   应用茎环逆转录引物进行逆转录，可以区分成熟的microRNA和premicroRNA；

  2.   应用BioTNT  miRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit，已经优化的适合特异茎环逆转录引物进行CDNA 合成的protocol，用于100个microRNA样本的已知第一链CDNA合成；

  3.   BioTNT 经验证的特异性茎环系统assay 可以提供您最方便的实验方案；采用了100Tests的包装，方便您的实验；

   

  产品特征：

  ² 本方法可以采用经典的trizol法抽提得到的总RNA；

  ² 检测的特异性：独特的miRNA茎环逆转录引物的设计技术及其优化的反应体系避免了非特异性扩增、特别是Pre-miRNA的污染；

  ² 检测分辨率高：该系统能分辨单碱基差异的miRNA；

  ² 一站式解决方案：BioTNT不仅提供检测的试剂盒，还提供经验证的人源、小鼠源、大鼠源的特异性microRNA assay；

  ² 检测灵敏度高：可在低至pg级的总RNA中检测到特异表达的miRNA；

  质量说明

• BioTNT  miRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit已包含有检测所需要的所有试剂, 客户仅需要提供RNA及BioTNT 特异性茎环系统assay即可进行miRNA检测；

• 我们提供的BioTNT 特异性茎环系统assay建议同BioTNT  miRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit配套使用；

• 我们承诺推出的每个BioTNT 特异性茎环系统assay都提供利用BioTNT  miRNA qRT-PCR sybgreen Detection Kit进行验证的报告，其报告内容包括验证流程、引物相应扩增曲线、融解曲线、及其推荐的反应条件, 同时还提供阳性的cDNA验证模板，客户可以参考此条件进行检测实验。

三、BioTNT QPCR microRNA 样本准备  

3.1 组织样本准备

  注意：BioTNT QPCR microRNA 检测的样本取样同Real time PCR的组织取样与保存：

1、 取动物的组织，动作要求迅速，尽量避免样本在环境中暴露太久；

2、 讲样本迅速放入无菌无酶的冻存管中，为保证质量，推荐选取Axygen，corning，nunc等国外品牌的冻存管；根据组织块的大小，确定RNA 抽提方式；如果组织块非常小，建议采用柱抽提试剂盒进行抽提（ RNeasy Micro Kit（50） 74004 

3、 在冻存管上做好标记，尽量清晰易辨；在实验记录本上做好记录，尽量详细易查；

4、 将冻存管放入液氮速冻，2h 后，转至-80度冰箱，可以保存6个月左右；

样本运输：干冰运输

3.3  血清/血浆样本准备：

建议采用血浆样本，可以得到相对更好的实验结果。

使用抗凝管采集全血，并尽快进行血浆分离：1000g离心10分钟，分离血浆和细胞组分。（注意：血浆收集应使用抗凝管，抗凝剂可以用柠檬酸钠或EDTA等，但一定不要使用肝素抗凝，因为肝素对后续实验有较大影响。）将采集好的血浆转移至单独的冻存管，按照每400-500ul/管分装好。
短期保存，可放入-20℃或-70℃冰箱。长期保存，请放入液氮。

3.4  全血样本准备：

请按照实际使用的收集方法，如注射器收集或真空收集管等，参考相应的厂商提供产品说明进行操作。
采集好全血，将采集好的全血转移至单独的冻存管，按照每500ul/管分装好。
短期保存，可放入-20℃或-70℃冰箱。长期保存，请放入液氮。

3.5  石蜡样本准备：

石蜡切片，至少三片；或者提供石蜡块，常温保存。

四、BioTNT QPCR microRNA 检测使用的仪器

进行检测使用的主要仪器为QPCR， BioTNT 使用life technology最新款的ViiA™ 7实时荧光定量PCR系统进行microRNA的QPCR 检测。

ViiA™ 7实时荧光定量PCR系统在单一的高性能仪器上融合了您需要的所有实时荧光定量PCR特性，从而帮助您优化研究效率。ViiA™7系统具有简单的工作流程、直观的软件、触控屏界面以及使误操作降至最少的单键实验方案，可提供出众的重复性和最小的孔间和仪器间差异。

产率
ViiA™ 7系统适用于中等至高通量实时荧光定量PCR，可提升您的实验室效率。
快速的加热块更换——前开门设计使热循环加热模块的更换变得更容易，无需移动旁边的设备，如机械臂或计算机
简单的触摸屏界面——仪器触摸屏提供了一键式实验方案，可快速简单地完成各种应用Assay的设置
自动化兼容性——ViiA™ 7系统结合了Applied Biosystems® Twister® II 机器人，使您在自动化环境下实现效率最大化

整合
可与TaqMan® Array微流体芯片和 Applied Biosystems® TaqMan® Assay完全兼容：实时荧光定量PCR分析的金标准，具有高灵敏度、高特异性和宽动态范围。
384 孔通量且无需机器辅助——采用TaqMan® Array微流体芯片，无需移液机器人或复杂的移液装置；只需加入您的样本和预混液，即可在ViiA™ 7系统上运行
与全套 TaqMan® Assay 兼容——ViiA™ 7系统已经过优化，可用于所有TaqMan® Assay(包括 MicroRNA、蛋白质、非编码 RNA 和Pri-miRNA Assay)，从而获得清晰简洁的数据

性能
ViiA™ 7系统具有下列特点：
OptiFlex® 系统——增强型荧光检测，可实现准确且灵敏的数据分析
最大程度的多重分析能力——6 个可自由组合的激发和发射滤光片通道，可实现最多的染料组合和最大的多重反应能力
灵活的数据采集——多种升降温方法检测形式为升降温阶段的荧光数据采集提供了更多的灵活性
精确定量——在单色反应中可检测出低至1.5倍的拷贝数差异

ViiA™ 7软件具有：
直观的界面和创新的设计
便捷的自动化操作
更强大的数据分析
与高通量完全兼容

可扩展的软件构架
提供可选的附加性能，可升级至现有软件。
遵循美国联邦法规第21章第11节(21 CFR Part 11)——可选的SAE模块，提供记录安全、审计和电子签名信息，从而实现全方位的数据可追溯性
高分辨率熔解曲线(HRM)——采用内置的MeltDoctor™ 实验方案和校准，您可以缩短优化运行的时间，从而将更多的时间用于分析您的结果。通过方便的软件设置即可根据需要设置基因型种类的数目。

），此时样本中不要加入trizol；如果组织块有100mg，可以采用trizol 法抽提总RNA的方式，进行样本的保存，在样本中加入1ml trizol 浸没样本；

3、 在冻存管上做好标记，尽量清晰易辨；在实验记录本上做好记录，尽量详细易查；

4、 将冻存管直接放入液氮中速冻；或加入1ml Trizol 到冻存管中，再放入液氮速冻；

5、 速冻2h 后，将冻存管从液氮转至-80度冰箱，可以保存6个月左右；

BioTNT QPCR microRNA 的细胞取样与保存

1、 悬浮细胞：500g 离心5min 取细胞，用PBS 清洗2-3遍，得细胞，并转至放入冻存管中；

2、 根据细胞量进行后续抽提方式的选择，如果细胞量大于5*10的5次方，可以采用trizol 方式进行总RNA 抽提，如果小于此量，建议采用Qiagen的柱式抽提

本产品仅供科研使用。不能用于人和动物治疗等其它临床诊断使用！